ghrelin对动脉硬化内皮细胞作用的临床和基础研究

【摘要】背景和目的：以动脉粥样硬化(atheroselerosis,动脉粥样硬化)为主要病理改变的心脑血管疾病严重威胁着人类健康。虽然众多科学家倾注了大量的心血进行研究,但是,由于动脉粥样硬化发病机制复杂,目前对其发病机制仍然存在许多未解难题。Ghrelin是一种由28个氨基酸组成的多肽,最早在胃的组织中被发现,后续研究认为它是生长激素的内源性配体,能够刺激生长激素分泌和增加摄食并减少脂肪利用,最终形成正能量平衡。最近研究发现,ghrelin除上述作用外,由于其本身及其受体在心血管系统的广泛分布,而被认为与心血管疾病存在某种联系。基础研究大多认为ghrelin对心血管具有保护作用,但是临床研究的结果却缺乏一致性,有部分研究发现外周血ghrelin水平与动脉粥样硬化程度指标——颈动脉内膜中层厚度(CIMT)呈负相关,既ghrelin是动脉粥样硬化的保护因素,而另外的研究却提示ghrelin与CIMT呈正相关关系或无关；并且目前尚未见ghrelin与动脉硬度指标——脉搏波速度(PWV)关系的临床研究报告。基于上述情况,本研究首先对老年代谢综合征患者的资料进行分析,并引入PWV评价大动脉僵硬度,综合评价血管情况,来阐述ghrelin水平与动脉硬化的关系。关于ghrelin与动脉粥样硬化的机制研究方面,由于氧化低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein,oxLDL)在动脉粥样硬化中的作用非常重要,其可通过多种途径促进动脉粥样硬化的发生发展,其中诱导血管内皮细胞凋亡为其初始作用之一；再有,内皮细胞的损伤和凋亡被认为是动脉粥样硬化形成的始动环节,并在其发展中起重要作用,与其他因素相互协同、相互影响,促进了动脉粥样硬化的发生发展,所以,本研究的基础研究部分,利用oxLDL诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡过程中加入ghrelin干预,并在此基础上加用LY294002(PI3K阻滞剂),PD98059(ERK1/2阻滞剂),以期分析其可能的细胞信号通路。临床研究部分：方法：本研究为横断面研究。2011年4月到2012年4月在我院就诊的年龄>60岁的老年患者5789人中筛选所有符合入选标准并同意参加本研究的代谢综合征患者142例为代谢综合征组(MS)。代谢综合征符合2004年中华医学会糖尿病分会提出的CDS诊断标准。另外筛选性别、年龄匹配的非代谢综合征老年人66例为对照组。测量身高、体重、血压等临床参数,并抽血检测ghrelin、血脂、血糖等生化指标,同时检测臂踝脉搏波速度(baPWV)和CIMT。采用SPSS13.0版统计软件进行统计分析,计量资料以x±s表示,计数资料以数量(率)表示。计量资料组间比较用独立样本t检验,计数资料用χ2检验。两个变量之间的关系用相关系数表示,多个变量之间关系用多元回归分分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果：MS患者ghrelin水平较正常对照组低(t=1.992,P=0.048),而CIMT(t=5.336,P=0.000)及baPWV(r=2.698,P=0.007)则较高;颈动脉狭窄发生率MS人群明显高于对照组(χ2=5.696,P=0.017)。MS组中ghrelin与baPWV(r=0.412,P=0.001)、CIMT(r=0.213,P=0.035)、LDL(r=0.412,P=001)、总胆固醇(r=0.305,P=0.000),年龄(r=-0.186,P=0.014).BMI(r=-0.553,P=0.014)相关,多元回归分析在调整了年龄、性别、血压、血糖等因素后(R2=0.318,P=0.023),ghrelin与baPWV(β=0.532,P=0.000,95%CI27.97～32.67)、LDL(β=-0.600,P=0.004,95%CI-216.66～-278.97)、BMI(β=-0.400,P=0.023,95%CI-29.82～-24.16)独立相关,与CIMT无关。结论：ghrelin水平在MS患者中较低。Ghrelin水平随动脉僵硬度增加及动脉粥样硬化斑块的加重而升高。老年MS患者中ghrelin随年龄增加而降低,随BMI增加而下降,随LDL升高ghrelin水平升高。基础研究部分：方法：第一步确定oxLDL对HUVEC细胞的作用：将细胞分为对照组,5mg/LoxLDL,10mg/LoxLDL,20mg/LoxLDL组,分别作用6小时,12小时,24小时,48小时。分别用MTT法和流式细胞仪法检测细胞凋亡情况。目的是获得oxLDL导致HUVEC细胞损伤的浓度及时间关系。第二步：在第一步的实验基础上将细胞分为对照组,10mg/LoxLDL干预组,10-6mol/Lghrelin干预组,10-8mol/Lghrelin组-10mg/LoxLDL,10-7mol/Lghrelin+10mg/LoxLDL组,10-6mol/Lghrelin+lOmg/LoxLDL组,分别用ghrelin预处理10分钟,30分钟,60分钟,120分钟后再用oxLDL处理120分钟,对照组用生理盐水干预,10mg/LoxLDL干预组在预处理阶段用生理盐水进行处理,10-6moI/Lghrelin干预组在干预阶段用生理盐水处理。完成上述处理后,分别用MTT法和流式细胞仪法检测细胞凋亡情况。目的是获得ghrelin对HUVEC细胞作用的浓度及时间关系。第三步：在以上实验结果的基础上(恰当的浓度和作用时间)将细胞分为对照组,oxLDL组,ghrelin组,ghrelin+oxLDL组,ghrelin+D-Lys-3-GHRP-6(ghrelin受体GHS-R1a阻滞剂,10-4mol/L在加用ghrelin前预处理1小时)组,ghrelin+oxLDL+LY294002(PI3K阻滞剂,10-5mol/L预处理1小时)组,ghrelin+oxLDL+PD98059(ERK1/2阻滞剂,5×10-5mol/L预处理30分钟)组。凋亡相关蛋白的表达及p-Akt、p-ERK1/2情况来进一步研究ghrelin抗HUVEC细胞凋亡的机制。第四步：在第三步的基础上加用ghrelin受体抑制剂D-Lys-3-GHRP-6、PI3K抑制剂LY294002和ERK1/2抑制剂PD98059。ghrelin受体GHS-R1a阻滞剂,10-4mol/L在加用ghrelin前预处理1小时,LY294002(PI3K阻滞剂)10-5mol/L预处理1小时,PD98059(ERK1/2阻滞剂)5×10-5mol/L预处理30分钟,然后分别加入ghrelin及oxLDL。观察细胞凋亡情况(MTT和流式细胞仪法)。结果：HUVEC细胞在不同浓度(5mg/L×10mg/L、20mg/L)和不同作用时间(10分钟、30分钟、60分钟、120分钟)的oxLDL干预后,细胞存活率均较对照组有不同程度下降,差异具有统计学意义。当oxLDL浓度达到20mg/L时,其影响HUVEC细胞生存的作用达到本研究观察到的最大效应(P<0.05)。HUVEC细胞的数量在oxLDL刺激10min后开始明显减少(P<0.05),于120min达到本研究观察的最高峰(P<0.05)。观察ghrelin对HUVEC细胞活性的影响结果显示,HUVEC细胞经不同浓度(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)ghrelin预处理10min-120min后,再加10mg/L的oxLDL培养120分钟,结果显示随ghrelin浓度增加和作用时间延长,HUVEC细胞存活数量也相应增加,在浓度达到10-6mol/L、作用时间达到30min时,较单纯oxLDL处理组差别具有统计学意义(P<0.05),浓度为10-6mol/L作用时间为120分钟时最为显著(P<0.05),HUVEC数量与对照组无显著性差异(P>0.05)。提示,ghrelin对HUVECs具有明显保护作用,能显著抑制oxLDL对HUVECs的损伤。单纯ghrelin处理组存活率较对照组没有明显差别,提示ghrelin在正常情况下对内皮细胞生长没有明显影响。不同浓度不同作用时间ghrelin处理组相比,发现ghrelin的内皮细胞保护作用呈时间和浓度依赖性。为进一步明确ghrelin对oxLDL导致的HUVECs细胞凋亡的保护作用机制,我们用WesternBlot法检测各组细胞凋亡相关蛋白的表达情况,包括Bcl-2蛋白、Bax蛋白、Cleavedcaspase-3表达,计算Bax/Bcl-2比值。Bcl-2蛋白：与对照组HUVEC细胞相比,oxLDL(10mg/L)可使Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05)；单纯ghrelin处理组则没有明显影响；加入ghrelin后,即10-6mol/Lghrelin和10mg/LoxLDL共处理组使Bcl-2的表达较单纯oxLDL组显著上升(P<0.05)。Bax蛋白：与对照组HUVEC细胞相比,oxLDL可使Bax蛋白表达量显著升高(P<0.05)；加入ghrelin后,即ghrelin和oxLDL共处理组使Bax的表达较mmol/L单纯oxLDL组明显下降(P<0.05)；与对照组比较,单纯ghrelin组Bax蛋白表达量无明显变化(P>0.05)。Bax/Bcl-2比值：与对照组]HUVEC细胞相比,oxLDL可使Bax/Bcl-2比值显著升高(P<0.05)；加入ghrelin后,即和oxLDL共处理使Bax/Bcl-2比值较单纯oxLDL组明显下降(P<0.05)；与单纯oxLDL处理组相比,单纯ghrelin处理组Bax/Bcl-2比值无明显变化(P>0.05)。Cleavedcaspase-3蛋白：与对照组HUVEC细胞相比,oxLDL可使Cleavedeaspase-3蛋白表达量显著升高(P<0.05)；加入ghrelin后,即ghrelin和oxLDL共处理使Cleavedcaspase-3蛋白表达量较单纯oxLDL组明显下降(P<0.05);与单纯oxLDL处理组相比,单纯ghrelin处理组Cleavedcaspase-3蛋白表达量无明显变化(P>0.05)。上述结果提示,oxLDL可以促进细胞凋亡蛋白Bax和Cleavedcaspase-3的表达,减少抑制细胞凋亡蛋白Bcl-2的表达；而ghrelin可以抑制oxLDL引起的Bax和Cleavedcaspase-3表达增加,促进Bcl-2表达,这可能是ghrelin对oxLDL引起的细胞损伤具有保护作用的重要机制。我们的研究表明,ghrelin可以激活Akt使之磷酸化为p-Akt,也可以激活ERK1/2磷酸化。所以推论ghrelin的生物学效应可能是通过Akt和ERK1/2激活磷酸化而产生。本研究显示经ERK1/2抑制剂(PD98059)预处理,可以抑制ghrelin引起的ERK1/2磷酸化,但不影响Akt激活；然而PI3K/Akt通路抑制剂(LY294002)可以同时减弱ghrelin引起的Akt和ERK1/2磷酸化。上述结果表明,ghrelin抗oxLDL导致的HUVEC细胞凋亡作用可能与激活PI3K/Akt和MAPK通路有关。Gherlin影响HUVEC细胞ERK1/2的作用达峰时间为30分钟,作用Akt的达峰时间为60分钟。本研究显示分别经10-4mol/L的ghrelin受体阻滞剂D-Lys-3-GHRP-6预处理1小时、5×10-5mol/L的ERK1/2抑制剂PD98059预处理30分钟、10-5mol/L的PI3K/Akt通路抑制剂LY294002预处理1小时后发现,上述各组细胞经MTT法和流式细胞仪法检测存活情况与对照组比较没有显著差别P>0.05,与oxLDL组比较存活率显著增高具有统计学差别P<0.05。提示：上述三种抑制剂对细胞存活没有明显影响。D-Lys-3-GHRP-6预处理后加用oxLDL和ghrelin处理的细胞其存活率较单纯D-Lys-3-GHRP-6预处理组和对照组有所下降,但高于oxLDL组,提示：ghrelin受体可能参与了ghrelin抑制细胞凋亡的过程,同时也可能存在GHR外的细胞通路。PD98059预处理后加用oxLDL和ghrelin处理的细胞其存活率较单纯PD98059预处理组和对照组有所下降,但高于oxLDL组,提示：ERK1/2通路可能参与了ghrelin抑制细胞凋亡的过程,同时也可能存在GHR外的细胞通路。LY294002预处理后加用oxLDL和ghrelin处理的细胞其存活率较单纯LY294002预处理组和对照组有所下降,高于oxLDL组,但MTT法结果没有统计学差别P=0.2088,提示：Akt通路可能参与了ghrelin抑制细胞凋亡的过程,由于该通路阻断后较其他两组阻滞剂效果更为明显,因此推断该通路可能是ghrelin抑制细胞凋亡的主要作用通路。结论：老年MS患者血清ghrelin浓度较低；在老年MS患者中,ghrelin浓度随动脉僵硬度增加及动脉粥样硬化斑块的加重而升高,其中与动脉僵硬度的关系不受传统危险因素的影响,与ghrelin独立相关；老年MS患者血清ghrelin水平随年龄、BMI增加而下降,随LDL水平升高而升高。本研究在体外实验中发现oxLDL能够造成内皮细胞损伤和凋亡；ghrelin干预可以减轻oxLDL对内皮细胞凋亡的影响,这种影响具有时间和浓度依赖性；ghrelin的上述作用可能不是或不完全是通过其特异性受体产生的；上述作用的主要机制可能与ghrelin特异性受体GHR、ERK1/2磷酸化、Akt磷酸化有关,其中Akt磷酸化关系最为密切。因此,综合上述结果推测ghrelin对血管内皮具有保护作用,最终的结论仍有待深入研究。
【作者】孙宁；
【导师】王林；
【作者基本信息】天津医科大学，内科学（专业学位），2014，博士
【关键词】ghrelin；脐静脉内皮细胞；凋亡；动脉粥样硬化；

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